PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶链式反应，是指在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。是一项DNA体外合成放大技术，能快速特异地在体外扩增任何目的DNA。可用于基因分离克隆，序列分析，基因表达调控，基因多态性研究等许多方面。

一、PCR反应成分：

1. 模板DNA；

2. 引物；

3. 四种脱氧核糖核苷酸；

4. DNA聚合酶；

5. 反应缓冲液、Mg2+等。

   
   

二、PCR反应基本步骤：

1. 变性(denaturation)：通过加热使模板DNA的双链之间的氢键断裂，双链分开而成单链的过程，高温使双链DNA解离形成单链（94℃，30s）。

2. 退火(annealling)：当温度降低时，引物与模板DNA中互补区域结合成杂交分子，低温下，引物与模板DNA互补区结合（55℃，30s）。

3. 延伸(extension)：在DNA聚合酶、dNTPs、 Mg2+存在下，DNA聚合酶催化引物按5’→3’方向延伸，合成出与模板DNA链互补的DNA子链，中温延伸，DNA聚合酶催化以引物为起始点的DNA链延伸反应（70～72℃，30～60s）

以上述三个步骤为一个循环，每一循环的产物均可作为下一个循环的模板，经过n次循环后，目的DNA以2n的形式增加。

总体积：一般为25μl～100μl

一、无Mg2+buffer：由纯水、kcl、Tris组成。Tris用于调节反应体系pH值，使Taq酶在偏碱性环境中反挥活性。kcl可降低退火温度，但不能超过50?mmol/L，否则会抑制DNA聚合酶活性。

二、Mg2+:终浓度为1.5～2.0mmol/L，其对应dNTP为200?μmol/L，注意Mg2+与dNTPs之间的浓度关系，由于dNTP与Taq酶竟争Mg2+，当dNTP浓度达到1?mmol/L时会抑制Taq酶的活性。?Mg2+能影响反应的特异性和产率。

三、BSA：一般用乙酰化的BSA，起着减少PCR管对Taq酶的吸附作用，对Taq酶有保护作用。

四、底物（dNTPs）：dNTPs具有较强酸性，其储存液用NaOH调pH值至7.0～7.5，一般存储浓度为 10 mmol/L，各成份以等当量配制，反应终浓度为20～200μmol/L。高浓度可加速反应，但同时增加错误掺入和实验成本；低浓度可提高精确性，而反应速度会降低。

五、Taq酶：能耐95℃高温而不失活，其最适pH值为8.3～8.5，最适温度为75～80℃，一般用72℃。能催化以DNA单链为模板，以碱基互补原则为基础，按5’→3’方向逐个将dNTP分子连接到引物的3’端，合成一条与模板DNA互补的新的DNA子链。无3’→5’的外切酶活性，没有校正功能。某种dNTP或Mg2+浓度过高,会增加其错配率。用量一般为0.5～5个单位/100μl。

六、模板：PCR对模板DNA的纯度不要求很高，但应尽量不含有对PCR反应有抑制作用的杂质存在，如蛋白酶、核酸酶、TqaDNA聚合酶抑制剂、能与DNA结合的蛋白质。模板DNA的量不能太高，否则扩增可能不会成功，在此情况下可适当稀释模板。

七、引物：引物浓度一般为0.1～0.5μmol/L，浓度过高会引起错配和非特异扩增，浓度过低则得不到产物或产量过低。引物长度一般15～30个碱基，引物过长或过短都会降低特异性。其3’末端一定要与模板DNA配对，末位碱基最好选用A、C、G（因T错配也能引发链的延伸）。

引物G+C约占45～55%，碱基应尽量随机分布，避免嘧啶或嘌呤堆积，两引物之间不应有互补链存在，不能与非目的扩增区有同源性。

温度参数：

1. 变性：模板变性完全与否是PCR成功的关键，一般先于94℃（或95℃）变性3～10min，接着94℃变性30～60s。

2. 退火：退火温度一般低于引物本身变性温度5℃。引物长度在15～25bp可通过公Tm=(G+C)×4℃+(A+T)×2℃计算退火温度，一般退火温度在40～60℃之间，时间为30～45s。如果(G+C)低于50%，退火温度应低于55℃。较高的退火温度可提高反应的特异性。

3. 延伸：延伸温度应在Taq酶的最适温度范围之内，一般在70～75℃。延伸时间要根据DNA聚合酶的延伸速度和目的扩增片段的长度确定，通常对于1kb以内的片段1min是够用的。

循环数：

PCR的循环数主要由模板DNA的量决定，一般20～30次循环数较合适，过多的循环数会增加非特异扩增产物，具体要多少循环数可通过预试验确定。

PCR产物积累规律：

反应初期产物以2n呈指数形式增加，至一定的循环数后，引物、模板、DNA聚合酶形成一种平衡，产物进入一个缓慢增长时期（“停滞效应”），即“平台期”。到达平台期所需PCR循环数与模板量、PCR扩增效率、聚合酶种类、非特异产物竟争有关。

问题一：非特异性扩增

产生原因及解决方法：

引物设计不合理：

如果引物与模板的结合位点过多，或者引物之间形成二聚体，都可能导致非特异性扩增。引物的长度、GC含量以及序列的特异性都会影响其与模板的结合效率。重新设计引物。

Mg2+浓度过高：

Mg2+是DNA聚合酶进行扩增反应所必需的辅因子。然而，如果Mg^2+浓度过高，它可能会降低引物与模板结合的特异性，从而导致非特异性扩增，降低浓度。

退火温度过低：

如果退火温度设置过低，引物可能会与模板的非特异性位点结合，导致非特异性扩增。适当提高退火温度，以增加引物与模板结合的特异性。可以通过梯度实验来找到既能保证引物与模板特异性结合，又能有效扩增目的条带的最佳退火温度。

模板中存在杂质：

模板DNA中可能含有杂质，如蛋白质、其他DNA片段或化学物质。这些杂质可能会干扰引物与模板的结合，导致非特异性扩增。尽可能使用高纯度的DNA模板进行PCR反应。

问题二：扩增不出目的条带

模板问题

1. 模板降解：模板DNA在提取、储存或操作过程中可能发生降解，导致无法有效扩增。使用新鲜制备的DNA模板。 

2. 模板含有杂质或抑制物：模板中可能含有蛋白质或其他杂质，这些物质会干扰PCR反应。对模板进行纯化或者降低模板浓度，以消除杂质和抑制物的干扰。  

3. 模板GC含量过高：高GC含量的模板在PCR过程中双链难以打开，影响扩增效率。更换适用于高GC含量模板的DNA聚合酶及相应的Buffer，或加入PCR增强剂以促进双链解离。  

4. 模板量不足：模板上样量过低，导致扩增信号微弱或无法检出。适当增加模板量，根据实验需求调整模板浓度。

引物问题  

1. 引物设计不合理：引物特异性不好，无法有效结合到模板上；或引物长度、GC含量等设计不当，影响扩增效率。重新设计引物，使用引物设计软件 Premier行序列比对和评分，选择特异性好、评分高的引物。  

2. 引物降解：引物在储存或使用过程中发生降解，导致扩增失败。检查引物的储存条件，避免反复冻融；使用新合成的引物进行尝试；

   
   

反应程序问题

1. 变性温度不足：变性温度过低或时间过短，导致模板DNA双链打开不完全，影响扩增效率。提高变性温度或延长变性时间。 

2. 退火温度不合适：退火温度过低导致引物与模板非特异性结合增加；退火温度过高则影响引物与模板的结合效率。优化退火温度，根据引物的Tm值设置合理的退火温度范围；进行梯度实验以找到最佳退火温度。  

3. 延伸时间不足：延伸时间过短导致DNA链延伸不完全，影响扩增产物量。根据DNA聚合酶的延伸速率和目的片段长度设置合理的延伸时间。 

4. 循环次数不足：循环次数过少导致扩增产物量不足或无法检出。增加循环次数以提高扩增产物量，循环数也不宜过多，会增加非特异性结合，摸索合适条件很重要。

问题三：产物出现拖尾现象

琼脂糖胶的问题：

如果凝胶在制备过程中没有完全融化，可能会导致电泳时DNA片段在凝胶中的迁移速率不一致，从而产生拖尾现象。未完全融化的凝胶区域可能阻碍DNA片段的正常迁移，导致电泳结果不清晰。

模板及引物发生降解：

如果模板DNA在提取、储存或操作过程中发生降解，会产生不同长度的片段。这些片段在PCR扩增后会在电泳结果中形成拖尾。引物在储存或使用过程中如果发生降解，也会影响PCR扩增的特异性，导致拖尾现象的产生。

酶的问题：

如果PCR反应中酶的用量过多，可能会导致PCR反应过度扩增，产生非特异性扩增产物，从而在电泳结果中形成拖尾。过多的酶会增加非特异性扩增的可能性，降低PCR反应的特异性。

问题四：高保真PCR发生突变

有小伙伴会遇到这样的问题，明明模板没有问题，可是为什么质粒构建成功后会发现序列出现突变，然后百思不得其解？

酶的问题

尽管高保真酶相较于普通Taq酶具有更低的错配率，但它们并非完全无误。所有酶在复制DNA时都可能引入一定的错误率。高保真酶通常通过减少错配碱基的插入和延伸，以及增强外切酶活性来纠正错配，但这些机制并非100%有效。

测序信号的可信度

在测序反应的开始和结尾部分，测序信号的可信度通常较低。这是因为测序技术的限制，导致在这些区域的信号质量下降，可能引入错误或导致突变被误读。因此，在分析测序结果时，我们需要特别注意这些区域的信号质量。

模板类型和质量

不同类型的模板对PCR扩增和测序结果的影响不同。例如，如果模板是质粒，通常经过克隆和验证，其序列相对稳定；而如果模板是cDNA，则可能包含由于转录过程中的错误或RNA编辑等原因引入的突变；模板DNA的质量对PCR扩增和测序结果至关重要。模板的降解、污染或损伤都可能导致扩增产物中出现突变。此外，模板的反复冻融或长时间紫外照射等不当处理也可能导致模板序列的突变。

突变类型的分析

如果多个测序样本在相同位置出现突变，这通常可以排除酶导致的随机突变的可能性。相反，这可能指向模板本身的问题（如模板中的固有突变）或其他系统性因素（如实验室污染）。

酶的影响

酶导致的突变通常是随机的，并且分布在整个扩增产物中。因此，如果突变集中在特定位置，则更可能是模板或其他因素导致的。

热启动PCR

常规PCR的扩增开始时间并不是放进PCR仪，运转程序才开始扩增。当体系配置完成的时候，扩增就开始了，这可能会引起非特异性扩增出现，热启动PCR可以解决这一问题。什么是热启动PCR？当反应体系配制好后，在反应初始加热阶段或“热启动”阶段，酶修饰物在高温下（通常高于90 ℃）被释放，使得DNA聚合酶被激活。具体激活时间和温度取决于DNA聚合酶以及热启动修饰物的性质。该方法主要利用抗体、亲合配体、或化学修饰物等修饰物，来抑制的DNA聚合酶的活性。由于DNA聚合酶在常温下的活性被抑制，热启动技术为在常温下配制多个PCR反应体系提供了极大的便利，且无需牺牲PCR反应的特异性。

逆转录PCR

逆转录PCR(Reverse Transcription PCR，RT-PCR)，是从mRNA逆转录成cDNA并以此为模板进行扩增的一种实验技术。实验流程是先提取组织或细胞中的总RNA，以Oligo（dT）为引物，利用逆转录酶合成cDNA，再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。

注：oligo(dT)是由数量少于20的脱氧胸苷酸连接而成的核苷酸链，它可以特异性地结合到mRNA的poly(A)尾端(多A尾)，从而使逆转录酶只能逆转录含有poly(A)尾的mRNA。

荧光定量PCR

荧光定量PCR（Real-time Quantitative PCR，RT-qPCR）是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对模板进行定量分析的方法。常用的qPCR方法有荧光染料法（SYBR Green I）和探针法（TaqMan）。染料法（常用SYBR Green Ⅰ）：在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，没有掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。探针法（常用TaqMan探针）：探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物的形成完全同步。

巢式PCR

巢式PCR（Nested PCR）是指利用两套PCR引物进行两轮PCR扩增，第二轮的扩增产物才是目的基因片段。如果第一对引物（外引物）的错配导致非特异性产物被扩增，相同的非特异性区域被第二对引物识别并继续扩增的可能性非常小，所以通过第二对引物的扩增，PCR的特异性得到了提升。进行两轮PCR的一个优势在于：有助于从有限的起始DNA中扩增得到足量的产物。巢式PCR的实验原理为根据DNA模板序列设计两对引物，利用第一对引物（称为外引物）对靶DNA进行15-30个循环的标准扩增；第一轮扩增结束后将一小部分起始扩增产物稀释100-1000倍加入到第二轮扩增体系中作为模板，利用第二对引物（称为内引物或巢式引物，结合在第一轮PCR产物的内部，进行15-30个循环的扩增，第二轮PCR的扩增片段短于第一轮。

降落PCR

降落PCR（Touchdown PCR）是一种通过调整PCR循环参数，提升PCR反应特异性的方法。在降落PCR中，前几个循环的退火温度设定为，比引物的最高退火温度（Tm）再高几度。较高的退火温度能有效减少非特异性扩增，但同时较高的退火温度会加剧引物与目标序列的分离，导致PCR的产量降低。因此在开始的几个循环中，退火温度通常设置为每个循环降低1℃，以增加体系中目的基因的含量。当退火温度降低到最佳温度时，剩余循环都维持此退火温度。通过这种方法，在PCR过程中，所期望的PCR产物得到有选择性的增加，而几乎不会出现非特异性的产物。

注：通过以较高的温度起始，再随着循环逐渐降低到最佳退火温度（黑色曲线），这种PCR方法可提升反应特异性（黄色曲线）。目标扩增子的产量（绿色曲线）相应的得到富集。

直接PCR

直接PCR是指直接从样品扩增目标DNA，无需进行核酸分离纯化。直接PCR分两类，直接法：取少量样本直接加入到PCR Master Mix中，进行PCR鉴定；裂解法：样本取样后，加入裂解液中，裂解释放基因组，取少量裂解上清液加入到PCR Master Mix中，进行PCR鉴定。这种方法简化了实验流程，减少了动手操作时间，同时可避免纯化步骤DNA的损失。

推荐具有高合成能力的DNA聚合酶用于直接PCR扩增。细胞碎片、蛋白、脂质和多糖也随DNA释放到裂解液中，它们会抑制PCR反应。具有高合成能力的DNA聚合酶可以耐受这些抑制剂，从而使直接PCR成为可能。具有高合成能力的聚合酶通常具有更高灵敏度，因此可从未纯化样本中扩增微量的DNA。

重叠延伸PCR

重叠延伸PCR技术 (gene splicing by overlap extension PCR，SOE PCR)，是采用具有互补末端的引物，使 PCR 产物形成了重叠链，从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸，将不同来源的扩增片段重叠拼接起来的技术。这项技术目前主要有两个应用方向：构建融合基因；基因定点突变。

反向PCR

反向PCR （Inverse PCR, IPCR）是用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA片段，对某个已知DNA片段两侧的末知序列进行扩增。反向PCR设计之初是为了用于确定邻近未知区域的序列，多用于研究基因的启动子序列；致癌性染色体重排，如基因融合、易位和转座；以及病毒基因整合，现在也常用于定点突变，复制一个具有预期突变的质粒。反向PCR流程，首先对模板进行限制性酶切消化和连接，选定的限制性内切酶不可剪切已知序列，从而使连接发生于侧翼未知序列之间。使用低浓度的酶切DNA片段优化连接步骤，使其倾向于自我连接而非多片段连接（即形成连环体）。完成自我连接后，从DNA的已知区域启动反向PCR。所获得的扩增子每个末端都含有部分已知DNA序列。随后，对这些扩增子进行测序，检测上述已知序列的相邻区域。

数字PCR

数字PCR（Digital PCR，dPCR）是一种核酸分子绝对定量技术。当前核酸分子的定量有三种方法，光度法基于核酸分子的吸光度来定量；实时荧光定量PCR（Real Time PCR）基于Ct值，Ct值就是指可以检测到荧光值对应的循环数；数字PCR是最新的定量技术，基于单分子PCR方法来进行计数的核酸定量，是一种绝对定量的方法。主要采用当前分析化学热门研究领域的微流控或微滴化方法，将大量稀释后的核酸溶液分散至芯片的微反应器或微滴中，每个反应器的核酸模板数少于或者等于1个。这样经过PCR循环之后，有一个核酸分子模板的反应器就会给出荧光信号，没有模板的反应器就没有荧光信号。根据相对比例和反应器的体积，就可以推算出原始溶液的核酸浓度。除了基因表达和拷贝数检测，数字PCR也适用于诸如低频等位基因的辨别、病毒滴定和二代测序文库的绝对定量。

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