免疫染色 (Immunostaining) 是一项重要的生物学技术，主要用于检测组织切片中的特定抗原并获取有关细胞结构的信息。
免疫染色是基于抗体与其靶抗原的特异性结合。抗原抗体复合物的检测依赖于与抗体偶联的标记物。使用酶时，需要酶的比色法或化学发光法底物。酶催化反应生成有色产物，可使用光学显微镜检测。对于荧光染料，可使用荧光显微镜测量荧光信号，无需额外的底物。
免疫染色：直接法 or 间接法
免疫染色主要使用两种方法：间接免疫染色法和直接免疫染色法。
间接法：同时使用一抗和二抗。一抗可特异性结合目标抗原。一抗通常在动物体内通过注射特定抗原而产生 (例如山羊、小鼠或兔子)。二抗通常与可检测标记物（例如酶或荧光染料）偶联，并与一抗结合。为防止交叉反应，最好使用与产生一抗的物种不同的二抗。多个二抗可以与每个一抗相互作用，从而增强可检测信号。此外，一种二抗可以与多种一抗一起使用。 直接法：使用与特异性结合抗原的可检测标记物偶联的单一抗体。该方法只需一步抗体孵育，比间接法更简单、更快捷。然而，由于直接法使用单一抗体，其灵敏度低于间接法，而且由于可用的探针/酶偶联一抗有限，其应用受到限制。
按标记物不同分类
按照标记物的种类，如荧光染料、放射性同位素、酶(主要有辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶)、铁蛋白、胶体金等，可分为免疫荧光法、免疫酶法、免疫铁蛋白法、免疫胶体金法及放射免疫自显影法等。
（1）免疫荧光法
将已知抗体标上荧光素，以此作为探针检查细胞或组织内的相应抗原，在荧光显微镜下观察，当抗原抗体复合物中的荧光素受激发光的照射后会发出一定波长的荧光，从而可以确定组织中的抗原定位或定量。
（2）免疫酶标法
基本原理是先以酶标记的抗体与组织或细胞作用，然后加入酶的底物，生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，通过光镜或电镜，对细胞表面和细胞内的各种抗原成分进行定位研究。
（3）免疫胶体金技术
免疫胶体金技术是以胶体金这样一种特殊的金属颗粒作为标记物。胶体金是指金的水溶胶，它能迅速而稳定地吸附蛋白，对蛋白的生物学活性则没有明显的影响。因此，用胶体金标记一抗、二抗或其他能特异性结合免疫球蛋白的分子(如葡萄球菌A蛋白)等作为探针，就能对组织或细胞内的抗原进行定性、定位，甚至定量研究。
由于胶体金有不同大小的颗粒，且胶体金的电子密度高，所以免疫胶体金技术特别适合于免疫电镜的单标记或多标记定位研究。由于胶体金本身呈淡至深红色，因此也适合进行光镜观察。如应用银加强的免疫金银法则更便于光镜观察。
免疫染色：IHC &ICC、IF的区别
ICC 与 IHC 均属于免疫染色。免疫组化 (Immunohistochemistry, IHC) 是用于检测组织切片中特定抗原或蛋白质，广泛应用于病理学，以诊断癌症等疾病和研究组织特异性蛋白质测定。当应用于细胞学制备时，通常称为免疫细胞化学 (Immunocytochemistry, ICC)，其适用于多种细胞学样本，例如细胞块、风干玻片、乙醇固定玻片、直接涂片、细胞离心涂片和液基细胞学 (Liquid-based cytology, LBC) 样本。ICC 常用于识别细胞中特定生物标志物的存在、亚细胞定位和原位大分子相互作用。
免疫荧光 (Immunofluorescence, IF) 也是利用抗体和抗原的结合特异性，是免疫染色的一种广泛应用的例子。IHC 通常使用多种不同的酶标记物来检测目标抗原。(IHC 也可升级为多重荧光染色的 mIHC)。ICC 通过使用与抗体偶联的荧光染料或酶，可以分别在荧光显微镜和光学显微镜下可视化目标抗原。IF 利用荧光显微镜检测与抗体结合的荧光染料，此外，IF 可进行多种荧光染色，允许研究人员进行多重标记，IF 的多重染色常用于评估大分子的共定位。
注意：对于多重染色，需要选择发射光谱不重叠的荧光染料，以防止光谱重叠导致信号错误解读。
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IHC典型应用
癌症标志物研究：通过检测癌症组织中特定蛋白的表达，可以帮助判断癌症的类型和分期。 疾病诊断：比如在免疫缺陷疾病、神经退行性疾病等研究中，IHC可用于检测相关病理标志物的定位和表达。 生物标志物筛选：通过标记不同的蛋白质，可以筛选和验证与疾病相关的分子标志物。 免疫组织学研究：揭示免疫细胞在各种疾病中的作用及其分布，推动免疫治疗的研发。 |
IHC实操流程
免疫组织化学 (Immunohistochemistry，IHC)，一种用于检测组织切片中特定抗原或蛋白质的方法。以已知的抗体为探针，与组织或细胞中的特定抗原 (如多肽、蛋白质等) 进行特异性的结合。随后，利用化学反应将这些抗原-抗体复合物进行可视化，从而实现对未知抗原在组织或细胞中的定性、定位甚至定量研究。
IHC 实验流程：通常包括样本固定、包埋、切片、脱蜡水化、抗原修复、灭活、封闭、一抗孵育、二抗孵育、显色、复染、封片观察 12 个部分。
样本固定
目的
充分保存细胞成分，包括可溶性和结构性蛋白质；
防止细胞成分 (包括抗原和酶) 自溶和置换；
稳定细胞材料，避免后续程序产生有害影响；
便于常规染色和免疫染色。
甲醛是常规组织学和免疫组织化学固定剂的金标准。甲醛主要保存肽和细胞器的一般结构。
基本步骤：
取材：从动物或人体取得所需的组织样本。对于组织块，要确保其大小适中，不宜过大，以便于固定液能够充分渗透。
初步处理：如果组织样本带有血液或其他体液，应先用生理盐水或 PBS 进行冲洗，以去除这些可能影响固定效果的物质。
固定：将组织样本放入固定液中。常用的固定液包括 10% 中性缓冲福尔马林 (Formalin，也称为甲醛)、甲醇、乙醇或它们的混合液等。固定液的量通常为组织体积的 10-20 倍，以确保组织能够充分浸入固定液中。大组织标本应切开固定，以免中间部分自溶解腐败。
☑固定时间根据组织类型和实验要求而定，一般固定时间室温 18-24 h。
固定后的处理：固定完成后，将组织从固定液中取出，用流水冲洗数分钟，以去除残留的固定液和可能产生的结晶。
注意事项：
固定的时间不宜过长，以免导致组织过度硬化和抗原性的丧失。
固定的温度通常为室温或 4°C，避免高温导致组织损伤。
在固定过程中，要确保组织样本完全浸入固定液中，避免出现未固定的部分。
固定的容器应干净、无杂质，避免对组织造成污染。
包埋
目的
保护和支撑组织样本，以便在切片时保持其完整性。通过将组织样本嵌入到固体介质中，可以制作出适合在显微镜下观察的薄切片。
常用的包埋介质包括石蜡、树脂等。石蜡包埋是免疫组化中最常用的方法，因为它可以有效保存组织形态，提升切片质量。树脂包埋则常用于需要更高分辨率或特殊染色方法的样本。
基本步骤：
脱水：在组织样本固定后，需要将其中的水分去除，以便于包埋介质能够充分渗透。酒精梯度脱水: 75% 乙醇、85% 乙醇、95% 乙醇、无水乙醇 (I)、无水乙醇 (II) 分别浸泡 30-60 min (5mm 组织块为例)。
透明：脱水后，组织样本会变得不透明，需要使用透明剂（如二甲苯）来去除其中的酒精和其他溶剂，使组织样本变得透明。通常用二甲苯浸泡两次，每次浸泡 30min。
浸蜡：将透明后的组织样本放入熔化的石蜡中，让石蜡充分渗透到组织样本中。这个过程通常需要在温箱中进行，以确保石蜡的均匀渗透。
包埋：将浸蜡后的组织样本放入模具中，倒入熔化的石蜡，然后让石蜡冷却凝固。这样，组织样本就被包埋在石蜡中了。
注意事项：
在包埋过程中，要控制好温度和时间，以确保石蜡的均匀渗透和组织的完整性。
包埋后的组织块需要冷却凝固后才能进行切片。在冷却过程中，要避免过度冷却导致石蜡碎裂或组织变形。
在包埋前，要对组织样本进行充分的固定和脱水处理，以确保其抗原性和完整性。
切片
目的
将包埋后的组织样本切割成薄片，以便于在显微镜下观察和检测。
基本步骤：
切片前的准备：确保包埋后的组织块已经充分冷却并固化。使用适当的切片机进行切片。
切片：将包埋好的组织块固定在切片机的样本夹上。调整切片机的切片厚度，通常为 4-5 微米厚，这个厚度是根据需要检测的抗原和实验要求来确定的。
展片：使用刷子或毛笔轻轻地将切好的组织切片从刀上取下，并放在温水 (40℃) 中展开。
烤片：60℃ 烤片 2 h。
注意事项：
在切片过程中，要控制好切片机的速度和切片刀的锋利度，以获得高质量的切片。
切片后，要及时对切片进行处理，以避免抗原的损失和组织的变性。
使用适当的黏贴剂，确保切片牢固地附贴在载玻片上，以便于后续的免疫组化实验。
脱蜡水化
目的
将组织切片从石蜡中释放出来，并使其恢复到适合进行后续抗原检测和染色的状态。
基本步骤：
脱蜡：切片首先被置于二甲苯中浸泡，以溶解和去除切片上的石蜡。通常，这个过程会分为多个步骤，每步大约持续 5 分钟，以确保石蜡被完全去除。例如，可以使用二甲苯 Ⅰ、二甲苯 Ⅱ 和二甲苯 Ⅲ 分别浸泡 5 min。
水化：依次置于无水乙醇 I、无水乙醇 II，95% 乙醇、85% 乙醇和 70% 乙醇中，各浸泡 1 次，5 min/ 次；再放入纯化水中清洗浸泡 5 min。
注意事项：
彻底脱蜡：脱蜡过程必须彻底，以确保石蜡被完全去除。否则，残留的石蜡会影响后续的抗原检测和染色。
避免干燥：在整个脱蜡水化过程中，应确保切片始终保持在湿润的状态，避免干燥。干燥会导致非特异性抗体结合，从而出现高背景染色。
抗原修复
目的
重新暴露或修正这些被封闭或扭曲的抗原，以提高免疫组化实验中的抗体与抗原的结合率，增强信号的强度和特异性。
最常用的修复缓冲液是 10 mM 的 pH 6.0 枸橼酸钠、pH 9.0 的 Tris-EDTA 、pH 8.0 的 EDTA。建议测试多种方法以寻找染色效果最佳的方法。
抗原修复的方法：
微波热修复：加入抗原修复液，放入切片，置于微波炉中火 8 min，停火 7 min，转小火 8 min；取出染色盒，冷却至室温。
水浴热修复: 加入抗原修复液，放入切片，置于水溶锅中加热，其间不断用温度计测其温度，待抗原修复液的温度达到有效度 (92℃)，维持 40 min 后取出染色盒，冷却至室温。
高压热修复: 在染色盒中加入抗原修复液，放入切片，置于高压锅内加热至饱压后继续加热 5 min，关闭电源，10 min 后取出染色盒，冷却至室温。
酶解修复：常用的消化酶有胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶 K 等。将切片置于含有酶解液的载玻片上，然后在适当的温度和湿度条件下进行酶解 (通常为 37°C，20 min)。酶解后，同样需要冷却切片至室温再进行后续处理。
注意事项：
加热后需自然降温；
使用过量的抗原修复液；
修复液的不同 pH 值对染色结果的影响比较大；
没有一种抗原修复缓冲液可以适用于所有抗原。不同的抗体可能需要不同的抗原修复方法和条件，因此需要根据实验要求和抗体特性选择合适的抗原修复方法。
灭活
目的
消除细胞或组织中内源性酶和活性物质的影响，降低背景噪音，提高实验的特异性和敏感性。
灭活内源性过氧化物酶：HRP 检测系统，常用的去除内源性过氧化物酶的方法是 3% 过氧化氢水溶液，室温 10 min。
洗涤：用 PBS 或 TBS 等缓冲液洗涤切片、浸泡 2 次，5 min/ 次。
注意事项：
H2O2 需现用现配，且 4℃ 避光保存，否则易引起非特异背景。
H2O2 孵育时间过长也会易引起脱片。部
分组织还含有内源性碱性磷酸酶，可用左旋咪唑进行灭活。
封闭
目的
封闭组织切片上非特异性结合位点，防止抗体与这些位点结合，从而减少背景信号。
基本步骤：
非特异位点封闭：将封闭液 (如 5% BSA 或血清等) 滴加到组织切片上，确保封闭液均匀覆盖整个组织区域。然后将切片放入湿盒中，在室温或 37°C 下孵育 30 min，让封闭液与组织切片充分作用。
洗涤：封闭结束后，用 PBS 或 TBS 等缓冲液洗涤切片，以去除未结合的封闭液和可能存在的杂质。
一抗孵育
免疫组化中的一抗孵育是免疫组化实验的关键步骤之一。
基本步骤：
选择一抗：根据实验目的选择特异性高、亲和力强的一抗。一抗应该与目标抗原的种属来源、类型等相匹配。
稀释一抗：根据一抗的效价和实验要求，用适当的稀释液 (如 PBS、TBS 等) 稀释一抗。
涂覆一抗：将稀释好的一抗均匀涂覆在已封闭的组织切片上，确保抗体能够充分接触组织切片上的抗原。
注意事项：
确保一抗的质量和特异性，避免使用过期或质量不佳的一抗。
充分洗涤组织切片，去除未结合的一抗和其他杂质，减少背景染色。
二抗孵育
二抗的作用是与一抗结合，形成抗原-抗体-抗体复合物，从而增强信号的强度和特异性。
在免疫组化实验中，二抗通常带有标记酶 (如 HRP.AP 等)，这些标记物在后续的显色步骤中可以产生可见的染色信号，便于在显微镜下观察目标抗原在组织中的分布和表达情况。
二抗孵育的基本步骤：
稀释二抗：参考二抗的说明书，按照适当比例用封闭液或其他适当的溶液稀释二抗。
孵育二抗：将稀释好的二抗滴加在已经过一抗孵育并洗涤的组织切片上，室温孵育 30 min-60 min。
洗涤：孵育完成后，使用洗涤液 (如 PBST 或 TBST) 在摇床上缓慢摇动洗涤切片，以去除未结合的二抗和其他杂质。洗涤通常需要重复几次，每次洗涤时间一般为 5-10 分钟。
注意事项：
二抗的选择和稀释比例应根据实验的具体要求和一抗的特性来确定。
显色
显色检测中需要考虑的其他因素有酶和显色底物的选择。每种检测酶都有几种不同的显色剂。HRP-DAB 是最常用的显色剂组合。
原理：在免疫组化中通常使用辣根过氧化物酶 (HRP) 或碱性磷酸酶 (AP) 等作为标记酶。这些酶能催化底物发生颜色反应，从而在抗原所在的位置形成可见的沉淀物。
基本步骤：
加入酶的底物 (如 HRP 的底物为 DAB，AP 的底物为 BCIP/NBT)。
底物在酶的作用下发生化学反应，形成有色沉淀物，通常呈现棕色 (对于HRP-DAB 系统) 或蓝色 (对于 AP-BCIP/NBT 系统)。
通过显微镜观察组织切片上的颜色变化，可以确定抗原在细胞或组织中的位置和表达水平。
注意事项：
选择适当的检测系统：根据实验目的和样本特性选择合适的检测系统；
优化条件：对一抗、二抗的浓度、孵育时间和温度等条件进行优化，以获得最佳的检测结果。
注意防护：DAB 为联苯偶氨化合物，可诱发皮肤癌和膀胱症，在显色操作过程中需注意防护。
复染
为了形成细胞轮廓，更好的定位目标蛋白，可进行复染。
复染：滴加 80-100 μL 苏木素染色液至完全覆盖组织，室温孵育 5 min，自来水冲洗返蓝。
注意事项：
复染的时间是需要摸索的，这个与苏木精的配制时间有关。
如果染色过浅可重复染色，如果染色过深可使用盐酸进行分化。
封片观察
封片步骤：
脱水：在完成所有染色步骤后，通常需要将组织切片进行脱水处理，以去除切片上的水分。切片依次使用 70%、85%、95% 乙醇、无水乙醇 I、无水乙醇 Ⅱ 分别浸泡 1 min。
透明：脱水后，切片需要进行透明处理，以便封片剂能够均匀分布在切片上。通常使用二甲苯浸泡两次，每次 1 min。
封片：将一滴封片剂 (如中性树胶、甘油明胶等) 滴在组织切片上，然后用盖玻片轻轻覆盖。封片剂的选择取决于实验要求和标本类型。封片时要确保没有气泡产生，并且盖玻片与切片之间紧密贴合。
干燥：让封片剂自然干燥，或者可以在温箱中加速干燥过程。干燥后的切片可以长期保存，并随时用于观察。
注意事项：
封好的切片可以长期保存，但应放置在干燥、避光、温度适宜的环境中，以避免切片受潮、褪色或损坏。
封片剂和某些化学试剂可能对人体有害，因此在进行封片操作时要注意安全防护措施，如佩戴手套、眼镜等。
IHC常见问题
1
染色弱？
可能性原因：
抗体浓度过低，孵育时间过短，可提高抗体浓度，延长孵育时间；
检查试剂是否超过有效期；
检查标本固定方式、抗原修复方式是否适合目标抗原；
未沥干切片水份，致使试剂稀释。建议滴加试剂前沥干切片中多余的缓冲液(注意防止切片干燥)；
孵育温度过低，若室温低于 15℃，要改放在 37℃ 孵育箱孵育 30-60 min (或 4℃ 冰箱过夜)。
2
产生非特异性染色？
在使用检测进行诊断之前，必须了解反应在细胞或组织内的预期抗原分布。如下图所示，CD79a 抗体仅染色了浆细胞瘤细胞的细胞核。根据目前对该抗原位置(细胞质和细胞质膜) 的了解，该反应被认为不是特异性的。
注：非特异的原因也有是因为修复方式不对，可能是修复太强了。
可能性原因：
抗体孵育时间过长、抗体浓度高易增加背景着色。这可通过缩短一抗/二抗孵育时间、稀释抗体来控制；
一抗用多克隆抗体易出现非特异性着色，建议试用单克隆抗体看看；
内源性过氧化物酶和生物素在肝脏、肾脏等组织含量很高 (含血细胞多的组织)，需要通过延长灭活时间和增加灭活剂浓度来降低背景染色；
非特异性组分与抗体结合，需延长封闭时间和适当增加浓度来加强封闭效果；
DAB 孵育时间过长或浓度过高；
洗涤不充分，可增加洗涤次数和洗涤时间；
染色过程中出现干片。干片容易导致非特异性染色，实验过程中需避免干片。
3
免疫组化染色呈阴性结果的原因？
可能性原因：
抗体浓度和质量问题以及抗体来源选择错误，重新确认抗体信息；
确认试剂是否遗漏，添加顺序是否正确；
抗原修复条件不合适，摸索最合适抗原修复条件；
组织切片本身这种抗原含量低，建议用已知阳性样本作阳性对照。
4
背景强？
可能性原因：
检查一抗和二抗浓度过高，需摸索合适的抗体浓度；
是否有效去除内源性酶和生物素，可延长内源性酶灭活时间；
血清封闭时间是否过短，可延长封闭时间；
检查一抗的特异性是否良好，选择特异性高的抗体；
适当增加抗体孵育后的洗涤次数和延长洗涤时间。
ICC/IF的典型应用
ICC/IF的典型应用
蛋白-蛋白相互作用：通过双标记，研究不同蛋白质之间的相互作用和共定位。 细胞内定位：研究特定蛋白质在细胞内的精确分布及其功能。 疾病研究与诊断：利用免疫荧光标记，追踪病理过程中的分子变化，研究免疫反应等。 多重标记分析：通过不同荧光染料标记多种目标，能够在同一细胞或组织切片上进行多种分子同时检测，深入了解细胞生物学过程。 |
ICC/IF: 实操流程
样品准备
细胞免疫荧光技术是一种基于抗体与标记物相互作用的技术。它通过特异性的抗体与细胞表面或细胞内分子结合，再通过标记物在荧光显微镜下进行观察。实验流程通常包括样品制备、固定、通透、封闭、抗体孵育、复染、封片和观察 8 个部分。
目的
根据实验设计，准备状态良好的细胞样品。细胞培养是实验的基础，细胞状态直接影响实验结果
步骤
准备盖玻片或共聚焦小皿。盖玻片需提前浸泡在 70% 乙醇中，盖玻片完全干燥后移至细胞培养板中，整个过程注意无菌操作。
铺细胞。在包被的盖玻片或板上铺适当的细胞，使后续固定细胞时，融汇度达到 50-60%。如果细胞过密或过稀，正常细胞结构可能会受到影响。
收集样品。针对贴壁细胞，细胞继续培养 12 h，细胞牢牢贴壁后，收集样品进行后续操作。而对于悬浮细胞，可以通过甩片进行。
注意事项：
尽量选用新鲜制备的样本，并确定样品中抗原分子的表达丰度；
后续所有操作，动作要轻柔，避免细胞脱落；
后续所有操作都需避免干片。
固定
目的
使用固定剂（如甲醇、丙酮、多聚甲醛等）处理细胞，使蛋白质变性凝固，从而固定细胞形态和结构。同时，固定剂还能减少或终止内源性或外源性细胞内分解酶的反应，防止组织细胞自溶，保护抗原性。
步骤
固定：使用 4% 的多聚甲醛固定细胞 10 ~ 15 min；
洗涤：使用 PBS 缓冲液清洗 3 次，以去除残留的固定液。
注意事项：
初次实验，建议从 4% 的多聚甲醛,固定 15 min 开始尝试，倘若没有达到预期效果，再调整固定时间或更换另一种固定剂。
较长的孵育时间通常会导致更高的固定程度，直至表位可能过度固定。孵育时间短可能导致表位保存不良和样品固定不足。最佳固定时间需要根据经验确定。
通透目的
通过去污剂部分溶解细胞膜，形成孔洞，从而使抗体能够到达细胞内表位，与细胞内的抗原结合。（该步骤可选做；通透步骤会破坏细胞膜，细胞膜表面抗原不适合选择通透实验）
步骤
通透：加入 0.1–0.25% Triton X-100 (PBS 配制)，覆盖细胞，室温下通透 5-10 min；
洗涤：使用 PBS 缓冲液清洗 3 次，以去除残留通透液。
注意事项：
通透剂的浓度和孵育时间应针对所用样品进行优化。
封闭
封闭液中的成分能够与细胞表面的非特异性位点结合，从而阻止抗体与这些位点的非特异性结合。
目的
根据实验设计，准备状态良好的细胞样品。细胞培养是实验的基础，细胞状态直接影响实验结果。
封闭液的选择
可以选择与二抗相同来源的血清或者 BSA 等，例如，若二抗为山羊抗小鼠，应选择山羊血清作为封闭剂。
步骤
使用 2-10% 的 BSA/山羊血清，室温或 37℃ 封闭 1 h。
注意事项：
封闭溶液不应含有一抗的宿主动物血清，因为这可能会导致高背景。
注意样品的保湿，避免样品的干燥，否则极易产生较高的背景。
抗体孵育
目的
使抗体充分与目的蛋白抗原结合，决定了荧光信号的位置和特异性，进而影响实验结果的准确性和可靠性。
注意：该步骤可选择 (i) 直接检测，一抗直接与荧光基团偶联。(ii) 间接检测，使用合适的荧光标记二抗检测一抗。这两种方法各有优点和缺点，其中，间接检测是最常用的检测方法。
抗体的选择
单染：一抗要选择任一宿主来源的抗体，二抗选择对应的抗一抗宿主的抗体。例如，一抗是小鼠来源，二抗要选择抗小鼠的抗体 (如山羊抗小鼠，驴抗小鼠等)。
双染/多染：在进行多个荧光标记实验时，一抗要选择不同宿主来源的抗体，二抗选择对应的抗一抗宿主的抗体。同时要注意选择具有高区分度的荧光二抗，避免荧光重叠。例如，在进行三色荧光标记时，一般选用绿色、蓝色和红色这三种荧光基团，以确保每个信号都能被清晰地区分出来。
基本步骤：
(以间接检测为例)：
一抗孵育：根据研目标抗原和样品特性选择符合要求的一抗，并按照说明书要求稀释一抗，加入到样品中并在 4℃ 条件下孵育过夜 (12 ~ 16 h)。
2洗涤：回收一抗工作液，用 TBST/PBST 摇床缓慢清洗 3 次，每次 5~10 min，以去除未结合的抗体。洗涤次数和时间可根据实验条件调整。
二抗孵育：根据一抗的种类及样品特性 (二抗携带的荧光需要与样品自带荧光不冲突) 选择合适的荧光标记的二抗，在室温下避光孵育 1 h。稀释和使用方法应遵循说明书。
洗涤：去除/回收二抗工作液，用 TBST/PBST 摇床缓慢清洗 3 次，每次 5 ~ 10 min，以去除未结合的抗体。洗涤次数和时间可根据实验条件调整。
注意事项：
孵育荧光二抗之后，一定要注意避光保存！
确定合适的二抗工作浓度浓度，避免无信号或背景过高现象的发生；
注意湿盒的保湿效果，避免样品的干燥；
洗涤时转速要温和，防止细胞脱片。
复染
目的
使用染色剂对细胞核进行染色，直观地区分细胞核和其他细胞及抗原结构的位置，便于观察和解读实验结果。
步骤
在清洗完毕的细胞中滴加 DAPI，室温避光静置约 30 s。
封片
目的
保护已经染色的样本，防止其受到外界环境的损害。同时，封片还有助于保存实验结果，便于后续的分析和比较。
步骤
封片：向载玻片上加入一滴封片剂，将盖玻片缓慢扣在载玻片上，细胞所在面靠近载玻片，用吸水纸吸除多余封片剂。
观察：轻轻用指甲油密封盖玻片四周，避免样品在显微镜下移动。指甲油干透后，直接观察或 4℃ 下避光保存。
注意事项：
避免气泡：在封片过程中，需要避免产生气泡。气泡会干扰显微镜下的观察，影响实验结果的准确性。因此，在滴加封片液时，需要缓慢而均匀地滴加，并用镊子轻轻调整盖玻片的位置，以确保没有气泡产生。
选择合适的封片剂：封片剂的选择也很重要。常用的封片剂包括缓冲甘油、抗荧光淬灭封片液等。在选择封片剂时，需要根据实验的具体需求和标本的特性进行选择。
保持避光和湿度：封片后，需要将标本放置在避光和湿度适宜的环境中保存。这可以有效地防止荧光信号的淬灭和标本的干燥，确保实验结果的稳定性和准确性。
细胞样品在封片剂处理后，理论上可以在 -20℃/4℃ 冰箱保存 1 周。然而，为了成像清晰和高荧光强度，建议尽快进行成像分析。
观察
成像及分析：在显微镜下观察并采集图像，并对结果进行实验分析。
IHC&ICC/IF实验技术的优势及其注意事项
优势：
高灵敏度与特异性：通过抗体的特异性结合，能够精确识别目标蛋白。
细胞与组织级别分析：无论是IHC还是ICC/IF，都能够提供蛋白质在组织或细胞内的定位及分布情况。
多重标记能力：尤其是免疫荧光，可以通过不同的荧光染料进行多重标记，帮助揭示复杂的生物学过程。
动态观察与定量分析：免疫荧光技术可以实时观察细胞内分子动态变化，而IHC则提供定量的蛋白表达数据。
注意事项：
抗体选择与优化：选择与目标蛋白特异性强、背景低的抗体，并优化抗体的浓度和孵育时间，以提高实验的灵敏度和特异性。
显色/荧光染料选择：显色法适用于IHC，荧光染料选择应根据实验需要来确定，注意染料的光稳定性和适配性。
负对照和阳性对照：设立合适的对照组（如未加一抗的负对照组），确保实验结果的可靠性。
组织处理和保存：对组织样本的处理（固定、切片等）要尽量温和，避免损坏细胞结构或导致抗原丧失。
各品牌实验应用简称指代不同
R&D Systems：应用中只要有IHC或者ICC/IF其中一项，则可以质保IHC及ICC/IF这两大类应用，其中IHC包括冰冻切片（IHC-Fr）和石蜡包埋切片（IHC-P）。如果应用中没有IHC以及ICC/IF，说明没有数据来支持这个应用，无法质保。
Novus ：除了应用列出的以外，部分根据种属同源性预测、引用文献报道或者客户Review列出的种属及应用，均属于质保范围。
特别注意： 1.不同于R&D Systems，Novus 的IHC与ICC/IF两种应用不能相互质保。 2.若有单独标志IHC的子类（IHC-Fr、IHC-P或IHC-Whole Mount），只质保单独标志的子类，如果只有IHC而无子类标志， 则质保所有的IHC子类。 3.若有(-)标志，代表验证过为阴性的种属或者应用，此类不属于质保范围。
Affinity：只区分样本类型，不区分检测信号。IHC: 适用于组织样本的石蜡(IHC-p)或冰冻(IHC-f)切片的免疫组化/荧光检测； IF/ICC: 单独表示细胞样本的荧光检测。
Proteintech（三鹰）：ICC/IF单独表示细胞免疫荧光；IHC: 适用于组织样本的石蜡(IHC-P)或冰冻(IHC-Fro)切片的免疫组化；IF：适用于细胞/组织样本的荧光检测；如果标注IF-P（石蜡切片的免疫荧光），可以质保IF-Fro（冰冻切片的免疫荧光）；如果标注IF-Fro（冰冻切片的免疫荧光），则不能质保IF-P（石蜡切片的免疫荧光），没有标注就代表没有验证或者验证没有通过。
Immunoway：只区分检测信号，不区分样本类型和样本制备类型。IF：适用组织/细胞的免疫荧光，其中组织样本不区分石蜡切片或冰冻切片。IHC: 适用于组织样本的石蜡(IHC-P)或冰冻(IHC-Fro)切片的免疫组化。质保范围同R&D Systems一样：应用中只要有IHC或者ICC/IF其中一项，则可以质保IHC及ICC/IF这两大类应用。应用IHC，质保IF/ICC；应用IF，质保IHC/ICC；应用ICC，质保IHC/IF。IHC/IF/ICC适用样本：细胞、组织样本的冰冻切片和石蜡切片。
华安生物：IHC-P：石蜡切片的免疫组织化学，IHC-Fr：冰冻切片的免疫组织化学，IF-Tissue：组织的免疫荧光（石蜡或冰冻切片），IF-Cell：细胞免疫荧光。
