在生命科学、临床诊断和生物制药领域，如果要评选一款应用最广泛、最经久不衰的蛋白检测工具，ELISA（酶联免疫吸附测定）必定榜上有名。
自1970年代问世以来，它就像实验室里的“老黄牛”，沉稳、可靠、数据扎实。尽管新技术层出不穷，但ELISA凭借其不可替代的优势，至今仍是许多诊断和研究的“金标准”。
它究竟有何魅力？今天，我们就来一探究竟吧。
什么是酶联免疫吸附实验 (ELISA)？
酶联免疫吸附试验（Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA）是一种对目的分子（如肽、蛋白、抗原、抗体和小分子等）定性或定量的检测方法，也是目前应用最广泛的免疫学检测技术之一。鉴于其强大的特异性和便捷性，ELISA通常被视为生物样品定量检测的金标准。 ELISA的原理是将抗原-抗体反应的特异性与酶催化作用的高效性相结合，通过酶作用于底物后的显色反应来判定结果。一般用酶标测定仪测定吸光度（OD值）来反映抗原或抗体含量，灵敏度可达每毫升纳克（ng/mL）水平甚至皮克（pg/mL）水平。 ELISA最初由斯德哥尔摩大学的Peter Perlmann和Eva Engvall以及荷兰Organon实验室的Anton Schuurs和Bauke van Weemen两个研究小组于1971年几乎同时提出[1]，也就是现在的直接法ELISA技术。 此后，日本宮崎大学和德岛大学科研团队在直接法的基础上进一步升级，于1977年研发出了夹心法ELISA技术[2]。夹心法ELISA基于抗体对研发，比直接法特异性更高，同时还无需抗原纯化，能适用于更复杂的样本。 划重点：ELISA操作方便、特异性强、数据分析简单、既可定性也可定量，结果明确易于解释，并且！它还经济实惠。 |
ELISA既可用于单份样品检测又可用于高通量筛选，可分析并定量各种样品类型（如细胞裂解物、组织裂解物或血清、血浆）中的一种或多种目标分析物，被广泛应用于临床诊断、药物研究和生命科学基础研究等各个领域，其按应用可分为研究工具和诊断工具两类。
ELISA作为研究工具
许多研究领域都会用到ELISA技术，其可以帮助研究人员了解细胞和组织中蛋白质的表达和调控，如磷酸化特异性和总蛋白评估、分泌蛋白表达、翻译后修饰评估、免疫学研究、神经学研究、癌症研究等。ELISA在药物的研发与监测中也发挥着重要作用，可用于筛选化合物库，以确定其与特定蛋白质的结合能力，从而识别潜在的候选药物以供进一步开发。同时，ELISA可用于监测血液或尿液中的药物或其代谢物的水平，以确保药物处于治疗水平且无毒性。
ELISA作为诊断工具
除了用于科学研究之外，ELISA还广泛用于诊断检测，包括对病毒感染、过敏测试、毒性和癌症的诊断检测，是一种快速便捷的临床检测手段，这种检测在扩展后可同时检测多份样品。
目前常见的ELISA方法共有4种，他们各有什么优劣势？原理有又有何不同呢？
ELISA分类及优缺点
目前常用的ELISA方法有直接法、间接法、双抗夹心法、竞争法。
直接法ELISA：利用固相抗原与酶标一抗之间的抗原抗体反应来检测抗原含量。抗原被动附着在固相载体（一般为96孔板）上，然后添加与酶（最常见的为HRP或AP）偶联的酶标一抗来检测抗原。经过孵育和洗涤后，添加显色底物（如TMB），利用酶的催化作用将无色底物转化为有色产物，短暂孵育并添加停止液终止酶活性后，读取显色情况。 间接法ELISA：间接法ELISA是检测抗体常用的方法。其在直接ELISA的基础上添加酶联二抗检测与固相抗原结合的受检抗体。总的来说，遵循直接ELISA的前几个步骤，包括固定抗原和封闭，添加一抗，但与直接ELISA不同，该一抗未偶联。然后添加相应的酶标二抗来检测该一抗，之后添加显色底物和停止液，最后读取显色情况。 竞争法ELISA（也称抑制或封闭 ELISA）：通过定量样品中非目标分析物的含量，来侧面确定目标分析物的含量。检测信号与样品中目标分析物的含量呈负相关。其原理是样本抗原与参比抗原竞争结合特定数量的酶标一抗，将参比抗原包被到固相载体上，然后将样本与酶标抗体一起孵育，游离抗体会与参比抗原结合，样本中的目标抗原越多，与参比抗原结合的标记抗体越少，信号越弱。 双抗夹心法ELISA：双抗体夹心法是检测大分子抗原最常用的方法。其将捕获抗原的抗体（捕获抗体）结合到固相载体上形成固相抗体，然后和待检样本中的相应抗原结合形成免疫复合物，洗涤后再加酶标抗体（检测抗体），与免疫复合物中抗原结合形成酶标抗体一抗原一固相抗体复合物，最后加底物显色，判断抗原含量。 |
ELISA的结果检测方法
ISA检测方法有很多，目前实验室中最普遍的方法是显色、荧光和化学发光法。这些方法取决于抗体的偶联物（通常是HRP或AP），在检测时，添加这些酶的底物，以产生比色、荧光或化学发光信号。使用的底物类型往往由多种因素决定，主要是根据所需的检测灵敏度和信噪比来选择。 显色法（比色法） 最常见的 ELISA 检测类型是比色检测。其原理是辣根过氧化物酶 (HRP-) 或碱性磷酸酶 (AP-) 偶联抗体与一种显色底物（例如TMB）溶液结合发生酶促反应。这种检测方通常使用酶标仪来测定各样品孔吸光度，互相比较样品，或用已知分析物浓度制成的标准曲线来确定样品浓度，一般使用透明孔板进行实验。 化学发光法 偶联AP或HRP的检测抗体还可用化学发光检测，在检测前同时添加过氧化物底物和鲁米诺，AP或HRP 会氧化鲁米诺，从而在 425 nm 处发光，该方法一般采用光度计读取信号。这种检测类型的优势是动态范围通常更宽，背景信号更弱，因此灵敏度提高。但信号不如其他两种检测类型稳定，并且产生信号后必须短时间内读取数据。当需要一个较大的动态范围时，通常使用化学发光检测。该方法一般在不透明的白色平板上进行。 荧光法 该种方法使用过氧化物酶偶联的检测抗体（即AP和HRP）和荧光底物反应。这种方法可以提供更强的信号和更宽的动态范围；但荧光底物的半衰期较比色底物短，因此，信号会在一段时间之后减弱。荧光检测需要使用黑色多孔板来最大程度地减少背景。此外，还需要使用荧光计读取信号。这类 ELISA 可用来检测免疫应答。另外，如果待测分子对于夹心检测而言太小，则推荐使用该方法。 |
既然了解了酶联免疫吸附实验 (ELISA)的原理、应用、分类、优缺点及其结果检测方法，那么接下来小编就带各位老师梳理下ELISA实验的步骤吧。
一、试剂与耗材准备
试剂：预包被或待包被酶标板、待测样本、标准品、捕获抗体、检测抗体、酶标二抗、洗涤液（如1X TBST）、封闭液（如5%脱脂奶粉或1% BSA）、底物溶液（如TMB A/B液）、终止液（如1-2M硫酸）。
耗材：无菌离心管、移液器吸头、封板膜等。
注意事项：
所有液体试剂在使用前应检查是否澄清、无沉淀或污染。避免试剂反复冻融，尤其是标准品、抗体和酶结合物。 所有试剂从4℃取出后需平衡至室温（≥30分钟），避免温度骤变影响反应活性。若浓缩洗涤液析出晶体，可在40℃水浴（≤50℃）加热溶解，混匀后使用。 标准品需提前溶解并梯度稀释，避免反复冻融。可拆卸酶标板条使用后，剩余板条需放回含干燥剂的箔袋密封保存。 |
二、样本处理
2.1血清
采集：使用无热原、无内毒素离心管采集血液。
分离：室温放置2小时或4℃过夜析出血清；2-8℃下1000g离心20分钟，收集上清。
保存：短期保存可在2-8℃冷藏或分装后-20℃/-80℃冻存（避免反复冻融）。
注意：倾斜离心管扩大液体横截面以提高血清分离效率；不可剧烈摇晃避免溶血 (红细胞裂解释放过氧化物酶可能导致HRP标记实验非特异性显色）。 |
2.2血浆
采集：使用含EDTA钠盐、肝素钠或枸橼酸钠的抗凝管。
分离：采集后30分钟内，2-8℃下1000g离心15分钟，收集上清。
保存：短期保存可在2-8℃冷藏或分装后-20℃/-80℃冻存（避免反复冻融）。
注意：检测前确认试剂盒对抗凝剂无特殊要求；避免溶血或高血脂。 |
2.3细胞培养上清
收集：直接吸取培养上清至离心管，2-8℃下1000g离心20分钟，去除细胞碎片 及杂质，收集上清备用。
保存：短期保存可在2-8℃冷藏或分装后-20℃/-80℃冻存（避免反复冻融）。
2.4 细胞裂解液
贴壁细胞：吸去培养基，胰蛋白酶消化后，培养基吹打悬浮；悬浮细胞直接收集。
洗涤：2-8℃下1000g离心5分钟，弃上清，预冷PBS洗涤3次。
重悬：预冷PBS(可添加蛋白酶抑制剂）重悬细胞（6孔板约1×106细胞/150- 250μL）。
裂解:-80℃（液氮）与30℃水浴交替冻融2-3次（反复冻融法）；200W超声2秒/次（间隔3秒），总3-5分钟（超声破碎法）。
收集：2-8℃下1500g离心10分钟，取上清-20℃/-80℃冻存（避免反复冻融）。
三、实验核心操作
3.1包被抗体
操作：用包被缓冲液（PBS或CBS)稀释捕获抗体至0.5-20μg/mL，每孔加100μL，4℃过夜或37℃孵育2小时。
关键：4℃孵育需密封酶标板防蒸发。
3.2封闭非特异性位点
洗涤：弃包被液，TBST洗板2-3次（每次3-5分钟）。
封闭：每孔加200-350μL封闭液（5%脱脂奶粉或1%BSA），室温孵育1小时或4℃过夜。
注意：封闭液需覆盖孔底，避免气泡残留。 |
3.3加样与孵育
样本/标准品：用样本稀释液稀释后，每孔加100μL，37℃孵育1-2小时。
操作细节：加样至孔底（避免孔壁/气泡）；不同样本更换吸头防交叉污染 。
复孔设计：每个样本至少2个复（CV≤20%）。
孵育条件：优先恒温箱（避免水浴锅温度不均）；酶标板单层平铺，避免重叠。
3.4 洗板
操作：弃反应液，TBST洗板3-5次（每次浸泡1-2分钟）；最后一次倒板，干净 纸巾轻拍去除残留液体。
技巧：洗涤液避免溢出（防相邻孔污染）；甩板垂直用力（120-150度旋转）， 避免手腕摇摆；人工洗板用吸水纸/滤纸拍干（禁用卫生纸防粉尘干扰）。
3.5加检测抗体
操作：每孔加100μ酶标检测抗体（如HRP标记抗体）或生物素标记抗体， 37℃孵育30-60分钟。
注意：二抗需与捕获抗体种属匹配（如小鼠抗体用抗小鼠HRP二抗）。 |
3.6显色终止读数
加TMB底物液（A液+B液按1:1混合），避光孵育10-15分钟至显色（蓝色）。
加终止液（1M硫酸），颜色由蓝变黄，终止反应后立即测OD值。
用酶标仪450nm（或450/630nm双波长）测定OD值。
标准曲线：以标准品浓度为横坐标、OD值为纵坐标，拟合四参数逻辑曲线（4-PL），计算样本浓度。
实验结果解读：
信号检测： 酶催化的底物反应产生可测量的信号，通常是光吸收或荧光强度的变化。 使用酶标仪（ELISA reader）测量每个孔的吸光度或荧光强度 通过构建标准曲线，将已知浓度的标准品在相同的条件下进行测定，以建立浓度与信号强度之间的关系。 样品的信号强度与标准曲线比较，从而计算出样品中抗原或抗体的浓度。 计算： 所有OD值建议减除空白孔值后再进行计算，如空白孔OD低于0.1，也可以直接计算。 以标准品浓度作横坐标，OD 值作纵坐标，手工绘制或用软件绘制标准曲线，根据样品OD值计算出相应含量，再乘以稀释倍数即可。 计算出相应含量，再乘以稀释倍数即可。 |
ELISA实验常见的问题及其解决方法
1.曲线较差：原因：标准品溶液配置错误、标准品复溶不当、标准品已降解、曲线标度不适合。解决方法：确认稀释正确、适当保存和处理标准品、尝试不同标度绘制曲线、使用经过校准的移液器。 2.无信号或信号弱：原因：孵育时间过短、样品中靶标含量低、样品类型不适用、抗原表位无法识别、检测缓冲液相容性问题。 3.解决方法：增加孵育时间、减小样品稀释倍数或浓缩样品、使用验证过的样品类型作为阳性对照、使用直接或间接ELISA方法增强检测能力、确保检测缓冲液与靶标兼容。 4.变异系数（CV）较大：原因：孔中有气泡、洗涤不均、试剂混匀不充分、移液量不一致。解决方法：读板前确保无气泡、检查洗板机、确保所有试剂充分混匀、使用校准的移液器。 5.背景偏高：原因：孔洗涤不充分、洗涤缓冲液污染、检测试剂过多、封闭缓冲液无效、抗体非特异性结合。解决方法：增加洗涤次数、制备新鲜洗涤缓冲液、减少检测试剂用量、尝试不同的封闭剂、使用适当封闭缓冲液。 6.灵敏度偏低：原因：试剂保存不当、靶标不足、检测试剂失活、测定方法不够灵敏。解决方法：按推荐方式保存试剂、浓缩样品或降低样品稀释度、确保酶/荧光素具有预期活性、更换更灵敏的检测系统或方法。 7.基质效应：解决方法：样本稀释、更换稀释液、优化实验体系。 8.显色问题：原因：显色时间不当、底物或酶失活。解决方法：优化显色时间、确保底物和酶新鲜且未失活。 9.加样、孵育、洗板和显色过程中的问题：解决方法：保证血清或血浆标本分离良好，及时放入孵箱，使用吸水纸吸干酶标板表面，严格按照操作步骤进行。 10.信号过强：解决方法：降低抗体浓度、稀释样品、缩短孵育时间、优化显色步骤。 11.交叉污染：解决方法：保持清洁和有序，避免样品或试剂的交叉污染。 |
